东汉到三国及两晋、南北朝时期(公元25年～581年)，我国医药学又有了较大的发展，针灸学术体系随之形成。当时腧穴定位已经出现了差异。如武威出土的东汉医简将足三里定在“膝下五寸”；吕广把太仓(中脘)定在“脐上三寸”等。于是魏晋年间著名针灸学家皇甫谧在魏甘露年间(公元256～260年)，汇集《素问》、《针经》(即《灵枢》)、《明堂孔穴针灸治要》三部著作中的针灸学内容，以类相从去其重复，删其浮辞撰成《针灸甲乙经》，成为我国最早的体系比较完整的针灸学专著。全书12卷，计128篇，其中有70余篇专论腧穴。对其穴名、别名、位置、取法、主治、配伍、何经脉气所发、何经所会、针刺深浅、留针时间、艾灸壮数、禁刺禁灸以及针灸意外等都作了全面论述。并对全身腧穴的分布进行了整理，头面躯干以分区划线排列，四肢以分经排列。为后世腧穴学的发展特别是腧穴归经奠定了基础。从此，历代传授针灸，研习经穴，莫不以《甲乙经》为规范。此后，名医葛洪在《肘后备急方》(简称《肘后方》)中首次记载了爪切或艾灸人中救治卒死；并提出了用“一夫法”量定腧穴。这个时期针灸经穴图也已经出现，称为《偃侧图》和《明堂图》等。
隋、唐时期(公元581～907年)，是我国封建社会的繁荣时期，医药学也有了长足的进步。鉴于两晋、南北朝以来，各家对腧穴的名称与定位又出现了混乱，且旧《明堂图》年代久远，传写错误，不足指南。唐政府在贞观年间(公元627～640年)令甄权等人考订明堂孔穴。孙思邈所撰《备急千金要方》(简称《千金方》)中腧穴定位，“一依甄权等新撰为定”，并绘《明堂三人图》，“其十二经脉五色作之，奇经八脉以绿色为之”，成为历史上最早的彩绘经络腧穴图(佚)。此外，杨上善撰《黄帝内经明堂》，对腧穴序列的编排，“以十二经脉各为一卷，奇经八脉更为一卷”，均不同于《甲乙经》和《千金方》的排列，并首次对部分腧穴的名称进行了解释。惜该书大部已散佚。
五代、辽、宋、金、元时期(公元907～1638年)，由于印刷术的普遍应用，加快了针灸学的传播和发展进程。在北宋政府的主持下，著各针灸学家王惟一于天圣四年(公元1026年)奉诏重新考订黄帝明堂，厘正腧穴定位，撰《新铸铜人腧穴针灸图经》(简称《铜人》)，并将内容刻石立碑，由政府颁布全国。次年铸成“铜人”两具，外刻经络腧穴，内置脏腑。是我国最早创立的金属经络腧穴模型，后来用“铜人”考试医生，一直沿袭到明代，促进了针灸腧穴的统一。元代名医滑寿著《十四经发挥》(简称《发挥》)，对经络循行和腧穴的联系进行了详细考订，书中将任、督两脉与十二经脉相提并论，合称“十四经”。并将全身腧穴按气血流注进行排列，即所谓十四经穴。
明代著名针灸学家杨继洲撰的《针灸大成》(简称《大成》)汇集了明以前针灸医籍的精华，是一部继《甲乙经》以后全面总结有关针灸学术经验和成就的传世之作。该书对腧穴的主治病证，分门别类加以论述，颇为详尽。及至清代，针灸学术逐渐落入低潮，在重药轻针的情况下，名医李学川提出为医应辨证论治，针药并重，左右逢源，病无所遁，因撰《针灸逢源》(简称《逢源》)。书中将历代针灸医籍中所载的十四经穴数目定为361穴，一直沿用至今。
鸦片战争后，我国沦为半殖民地半封建社会，针灸学术的发展陷入停滞。中华人民共和国成立以来，随着中医药学事业的复兴与发展，使针灸学术得到了前所未有的普及与提高。医学科学工作者应用现代科学知识和方法，对腧穴的形态结构、生物物理特性、临床应用、作用机理、腧穴与针感、腧穴与经络、脏腑相关等时行了大量的临床和实验研究，取得了不少成绩。
近年，随着我国针灸学术的迅速发展和国际针灸学术交流的需要，对穴名、读音、经穴数目和排列次序等都已作了统一规定。1989年，国家中医药管理局组织全国有关专家，经过反复推敲论证，对人体十四经361个腧穴及部分经外奇穴的定位进行了审定，制订出标准化方案，并于1991年起在全国范围内实施，对今后腧穴学的发展将产生深远影响。